核心原理：朗伯-比爾定律

 

　　超微量分光光度計的理論基石與經典儀器無異，即朗伯-比爾定律。該定律指出，當一束平行單色光通過均勻、非散射的溶液時，溶液的吸光度（A）與溶液的濃度（c）、光程（l）成正比。其數(shù)學表達式為：A=εcl。其中，ε是物質的摩爾吸光系數(shù)，一個與物質本身及波長相關的常數(shù)。

 

　　理解這個公式是理解一切的基礎：儀器通過測量樣本的吸光度（A），在已知光程（l）和吸光系數(shù)（ε）的情況下，就能精確計算出樣本的濃度（c）。

 

　　工作流程詳解：從一束光到一組數(shù)據(jù)

 

　　第一步：樣本加載與液柱形成

 

　　與傳統(tǒng)儀器使用比色皿不同，超微量技術的關鍵在于微體積樣本的呈現(xiàn)方式。用戶使用專用的加樣器，將0.5-2μL的待測樣本點位于一個特殊的檢測基座上。通過上下基座的閉合與分離，樣本在兩者之間依靠液體的表面張力，形成一個穩(wěn)定的懸柱液膜。這個液柱的厚度，即為光通過樣本的實際光程。超微量儀器的光程極短，通常在0.2mm到1mm之間，這正是在極低濃度下仍能保持吸光度值在線性范圍內的關鍵，避免了傳統(tǒng)長光程（通常1cm）下高濃度樣本需要過度稀釋的問題。

 

　　第二步：全光譜光源與單色化

 

　　儀器啟動后，內置的氙閃光燈或脈沖式鎢燈會發(fā)出一束覆蓋紫外和可見光區(qū)的全光譜復合光。這束光首先通過一個精密的光柵。光柵如同一個高效的“分光棱鏡”，可以將復合光色散成連續(xù)不斷的不同波長的單色光。通過控制光柵的旋轉角度，系統(tǒng)能夠精準地篩選出特定波長（例如，用于測核酸的260nm或測蛋白的280nm）的單色光，并將其導向樣本。

 

　　第三步：穿過樣本與光的吸收

 

　　經過調制的單色光，通過精密的光路系統(tǒng)，垂直穿過之前形成的懸柱液膜。樣本中的待測物質（如DNA的堿基、蛋白質的芳香族氨基酸）會選擇性地吸收特定波長的光。例如，DNA在260nm處有最大吸收峰。被吸收的光子能量使得分子發(fā)生能級躍遷，從而導致透射過樣本的光強度減弱。

 

　　第四步：信號檢測與參考比對

 

　　穿過樣本的透射光被一個高靈敏度的檢測器（如CCD或光電二極管）捕獲。檢測器將光信號轉換為微弱的電信號。這里有一個精妙的設計：在測量樣本之前，儀器會先用一個空白對照（通常是同樣體積的緩沖液或水）進行同樣的測量，記錄下初始光強度（I?）。測量樣本時，記錄的是透射光強度（I）。根據(jù)吸光度的定義A=log??(I?/I)，儀器內部的微處理器可以瞬間計算出樣本在特定波長下的準確吸光度值。

 

　　第五步：數(shù)據(jù)計算與結果輸出

 

　　這是將物理信號轉化為化學信息的最后一步。微處理器根據(jù)預設的程序和算法進行一系列復雜的運算：

 

　　1.濃度計算：對于DNA，系統(tǒng)會調用其已知的吸光系數(shù)（例如，dsDNA的ε為50ng/μL/cm），并結合實際測量的極短光程，通過A=εcl公式變形為c=A/(ε×l)，直接計算出濃度（ng/μL）。

 

　　2.純度評估：系統(tǒng)會讀取樣本在多個特征波長下的吸光度。例如，通過計算A260/A280和A260/A230的比值，來判斷核酸樣本中是否殘留有蛋白質、酚類或鹽離子等污染物。

 

　　3.光譜掃描與質量判斷：在光譜掃描模式下，光柵會連續(xù)掃描一段波長范圍（如220nm-700nm），繪制出完整的吸收光譜圖。光譜的峰形、平滑度可以幫助判斷樣本的降解情況或是否存在異常物質。

 

　　最終，所有這些處理后的信息——包括濃度、純度比值、吸光度值以及光譜圖——都會被清晰地呈現(xiàn)在儀器的觸摸屏或連接的電腦軟件上，完成一次完整的分析。